“Time Dependet Effect Of Etonogestrel On Caspase 3 Immunereactiveties And Apoptotic Indexes Of Rats’ Uterine And Ovarian Tissues”
Dr. Nicel TAŞDEMİR*,  Dr. Beril YÜKSEL*, Dr. Sevtap KILIÇ*, Dr. Neşe LORDLAR**, Dr. Gülnur ÖZAKŞİT*

Özet
       
Giriş: Apoptozis, gonadlarda hücresel yapım ve yıkım dengesinde gereklidir ve yetersiz veya gereğinden fazla olması çeşitli patolojilerle kendini gösterir. Çalışmamızda jinekoloji pratiğinde yaygın olarak kullanılan implant şeklindeki progestronların over ve uterus üzerindeki apoptotik etkileri bir rat düzeneğiyle değerlendirilmiştir.
Gereç ve Yöntem: Deney için 24 wistar-albino rat kullanılmıştır. Ratlara etonogestrel(IMP) implante edilmiştir (n=18). Takiben ratlar 10, 30 ve 50. günlerde sakrifiye edilmişlerdir(n=6). Kontrol grubu olarak 6 rat seçilmiştir. Over ve uterus dokuları  apoptotik indeks(AI) ve kaspaz 3 immünreaktivitesi(HScore) açısından değerlendirilmiştir. 
Bulgular: IMP uygulanan ratlarda, uterus stroma ve glandüler epitelinde AI ve HScore değerleri, progesterona maruziyet süresi arttıkça yükselmiştir. Endometriumda klinik olarak anlamlı AI ve HScore değişimi gözlenmemiştir. Overler de ise gerek granüloza gerek teka-lutein hücrelerde AI ve HScore değerleri yine uygulama süresi ile korele olarak  artmıştır. Özellikle teka-lutein hücrelerde bu artış 30 gün ve  sonrasında daha belirgin izlenmiştir.
Tartışma: Progesteron, uterus ve overlerde süre bağımlı olarak  apoptozisi arttırmaktadır. Uterustaki bu etki literatürle uyumlu ve beklendiği gibidir. Fakat bu çalışmada artan sürelerde bu etki güçlenmektedir. Overlerde ise, bazı kaynaklardan farklı olarak, apoptozis kronik uygulamada artmaktadır. Bu etki, direkt progesteronun etkisinden ziyade sürekli oluşan gonadotropin süpresyonuna ve seks hormonu bağlayıcı globülin seviyesindeki azalmaya bağlı artan serbest androjen miktarına bağlı olabilir. Uzun süreli progesteron kullanımı sonrası overlerde gözlenen bu apoptotik etkinin, progesteronun implant formunda gözlenen, ilaç kesildiğinde  fertilitenin geç geri dönüşü ile birleşmesiyle, kadın hayatındaki toplam fertil sürenin azalabileceği düşünülebilir.

Summary
 
Introduction: Apoptosis is necessary for the balance between  cell proliferation and cell loss. Various pathologies are related  with excessive or deficient apoptosis. We evaluated apoptotic  effect of widely used implantable progestines on ovarian and uterine tissues via rat study design.
Material and Method:  Twenty-four Wistar-Albino rats were used. Etonogestrel(IMP) was implanted in 18 rats. After application of drugs, 6 rats were sacrificed at the each 10th, 30th and 50th days. Six rats served as controls. Ovarian and uterine tissues were evaluated for apoptotic index(AI) and caspase-3 immunoreactivity (HScore).    
Results: In IMP used groups, AI and HScore values in stroma and glandular epithelium of uterus increased with the longer progesterone exposure time. AI and HScore values did not change in endometrium. AI and HScore values also increased with the longer progesterone exposure time in both granulosa  and teca-lutein cells of the ovary in IMP groups. Particularly, increase in AI and HScore values were more prominent after 30 days of progestine exposure for teca-lutein cells of ovary.
Discussion:  Progestine increased apoptosis in ovaries and uterus by the longer exposure time. This effect on uterus is consistent with literature. Apoptotic effect is more prominent by the longer exposure time. Apoptosis increased in ovaries  by chronic progesterone exposure which is in contrast with some studies in literature. This effect might be related with chronic supression of gonadotropins and elevation of androgens due to decreased SHBG levels which are indirect effects of progestines.  Late reversal of fertility with depot and implant forms of progestines when combined with their apoptotic effects it could be considered that longer duration of progestin usage can cause a shorter period of fertile life.

GİRİŞ

     Vücudumuzdaki tüm dokularda hücre çoğalması ve yıkımı bir denge halindedir. Apoptozis de bu dengenin kurulmasında önemli bir yer teşkil eder. Önceleri fizyolojik hücre ölümü olarak bilinen apoptozisin, günümüzde çeşitli patolojilerin (AIDS, nörodejeneratif hastalıklar, immünolojik hastalıklar vs.) etyopatogenezinde rolü olabileceği düşünülmektedir. Bu da, apoptozisin meydana geliş mekanizmasının, yapılan çalışmalarla daha net ortaya koyulabilmesi ile olmuştur (1, 2, 3, 4).
     Overlerde de apoptozisin önemli bir yeri vardır. Bunun temel sebebi oositlerin büyük çoğunluğunun kaderinin atreziye gitmek olmasıdır. Hayat boyu az miktardaki oosit ovüle olabilmektedir. Bu atrezi süreci daha insan dünyaya gelmeden önce başlar ve tüm üreme çağı boyunca devam eder. Apoptozisin bu süreçte önemli fonksiyonu vardır. Bu fonksiyondaki sapmalar çeşitli patolojilerle karşımıza gelebilir (5). Jinekoloji ve obstetri pratiğinde progestinler yaygın olarak kullanılmaktadır (kontraseptif amaçlı, disfonksiyonel uterin kanama tedavisinde, endometrial hiperplazi tedavisinde, luteal faz desteği amaçlı, düşük tehdidinde vs.).  Bu ilaçların major yan etkileri göz ardı edilebilecek düzeyde görülmektedir. Kullanım şekilleri siklik veya sürekli olarak değişmektedir. Özellikle kontrasepsiyon amaçlı kullanımlarda sürekli uygulama daha yaygın tercih edilmektedir.
     Çalışmamızdaki temel amacımız, yaygın kullanımı olan bu ilaçların, özellikle depo formlarına uzun süreli maruziyet ile kadın gonadllarında olabilecek muhtemel etkilerini ortaya koyabilmektir. Literatürdeki diğer çalışmalardan farklı olarak, özellikle süre bağımlı olarak meydana gelen etki ortaya konulmak istenmiştir. Bunun için prospektif, kontrolü bir hayvan deney düzeneği oluşturulmuştur.

GEREÇ VE YÖNTEM

Hayvan Metodu;
     Çalışma öncesinde  "Ankara Eğitim ve Araştırma Hastanesi Deneysel Araştırma ve Hayvan Laboratuarı Deney Hayvanı Etik Kurulundan " ve "Dr. Zekai Tahir Burak Kadın Sağlığı Eğitim ve Araştırma Hastanesi Etik Kurulundan" onay alındı. Toplam 24 adet 4-6 aylık, 220-230 gr ağırlığında sağlıklı, virgio, dişi, Wistar-Albino cinsi ratlar deney için temin edildi. Ratların bu deney için seçilmesindeki temel amaç bu hayvanların ucuz yolla elde edilmesi, kolay çalışılabilmesi ve bilimsel araştırmalarda en fazla bilgiye sahip olduğumuz türlerden biri olmasıdır. Ratlar sabit 12 saatlik aydınlık karanlık (ışıklar 08:00 ile 20:00 arası açık) siklusu ile ve serbest beslenme ile standart koşullarda barındırıldı. Siklusu tespit etmek için günlük vajinal smearlar alındı.
     Ratlar deney için rastgele toplam 4 gruba ayrıldı. Her gruba 6 adet rat alınarak,  etonogesterel (İmplanon(r), Organon, İstanbul, Türkiye) proöstrus dönemde ratların sırt derisine subkutan implante edildi. İşlem intramuskuler 100 mg/kg ketamin hidroklorid (Ketalar(r), Pfizer, İstanbul, Türkiye) ve 2,5 mg/kg xylazin (Rompun, Bayer, Leverkusen, Almanya) anestezisi altında ve steril şartlar altında yapıldı. Sırt derisi traşlanıp, povidon iyot uygulandıktan sonra 1 cm'lik insizyondan, mikrotom ile 5 mikron kalınlığında kesilerek hazırlanmış olan implant yerleştirildi. Cilt 3-0 polypropylene (Prolene(r), Ethicon, Livingston, UK) ile kapatıldı. İmplant uygulamaları pro-östrus siklusunda yapıldı. Son grup ise (n=6) kontrol grubu olarak seçildi. Kontrol grubuna sham ameliyatı yapıldı. Daha sonra etonogestrel implante edilen ratlar (n=18), ilaç uygulamasından sonra, birinci grup 10 gün sonra, ikinci grup 30 gün sonra, üçüncü grup 50 gün sonra sakrifiye edildi. Hayvanların tümü östrus siklusundaydı. Ratların ağırlıkları tedavinin veya cerrahinin ilk günü kaydedildi. Ağırlıklar arasında anlamlı fark olmadığı gözlendi.
     Çalışmada progesteronun implant formunun seçilme nedeni ratlar üzerinde sürekli ve sabit konsantrasyonda hormon etkisinin daha kolay sağlanabilmesi ve standardize edilebilmesidir.

İmmünohistokimyasal ve Histolojik Metod;
     Sakrifiye edilen hayvanların overleri ve uterusları eksize edilip, serum fizyolojik ile yıkandıktan sonra %10 formol ile fikse edildi. Fiksasyon sonrası dokular sırasıyla %50, %60, %70, %80, %90, %100 ethanol serilerinden geçirilerek dehidrate edildi. Ardından 1/1 oranında immersiyon yağı ve alkol içinde 1 saat tutulduktan sonra, transparanlık için bir gece immersiyon yağında bekletildi.  Ksilol uygulamasının ardından 1/1 oranında ksilol ve parafin karışımı içinde ve takiben 6 saat inkübatör içinde parafinize edildi. 4 mikron kalınlığındaki kesitler tekrar dehidrate edilerek hematoksilen-eozin boyası ile boyandı. Fiksasyon sonrası dokular rutin ışık mikroskobik inceleme ve immünohistokimyasal inceleme için ethanol serilerinden geçirilerek dehidrate edilmelerinin ardından parafinlendi. Parafin bloklara alınan over dokuları 4 mikron kalınlığında kesildi. Kesitler lam üzerine alınarak poli-L-lizin ile muamele edildikten sonra 37 C 'de 1 gece inkübe edildi. Bunu takiben 60 C 'de 1 saat inkübe edildi. On beşer dakikalık iki xylol uygulaması sonrası kesitler %96 saf alkol ve %80 etanol solusyonuna her birine 10 dakika olmak üzere batırıldı. Ardından iki kez 5 dakika disitile suya batırıldı. Antijen eldesi için kesitler, sitratlı tampon (Catalog # AP-9003-500, Lot CT14070,  LabVision Corporation, Fremont, CA, USA) içerisinde mikrodalga fırına alınarak, 5 dakika 650 watt ve takiben 3x5 dakika 550 watt ısıya maruz bırakıldı. Oda ısısında 20 dakikalık soğuma sürecinden sonra, lam üzerindeki dokular pap-pen(hidrofobik kalem) (Super Pap pen, PN IM3580, Beckman Coulter Company, France) ile belirlendi. Sonrasında kesitler disitile su ve fosfat tamponlu salin(PBS)(PBS, Lot 0446B002, LabVision Corporation, Fremont, CA, USA) ile yıkandı. Endojen peroksidaz aktivitesinin blokajı için 20 dakika %3 lük hidrojen peroksit solusyonu(Catalog #TA-125-HP, Thermo Scientific, Fremont, CA, USA) uygulamasından sonra, PBS ile yıkanan kesitlere 5 dakika süreyle ultra V blok (Catalog #TA-125-UB, Thermo Scientific, Fremont, CA,USA) uygulandı. Sonrasında dokular, 1 saat süreyle antikor diluenti ( Catalog # TA-125-UD Thermo Scientific, Fremont, CA,USA) ile dilue edilmiş, primer antikor (Caspase-3 Catalog #RB-1197, Thermo Scientific, 47777 Warm Spring Blvd, Fremont CA,94539, USA) ile inkübe edildi.  PBS ile yıkanan dokulara takiben 20 dakika süreyle sekonder antikor biotinli keçi antipolivalanı uygulandı (Catalog #TP-125-BN, Thermo Scientific, Fremont, CA, USA). Dokular PBS ile yıkandıktan sonra, streptovidin peroksidaz (TP-125-HR, Thermo Scientific, Fremont, CA, USA) ile 20 dakika muamele edildi. PBS ile tekrar yıkandıktan sonra örnekler AEC(3-147 Amino-9-Ethyl Carbazole, Substrate system, Cat number TA- 148 060-HA, Lab Vision, USA) kromojene 10 dakika maruz bırakıldı. Son olarak örnekler Mayer's Hemotoksilen (Catalog # TA-125-MH, Lot MH13533, LabVision Corporation, Fremont, CA, USA) ile 2 dakika boyandıktan sonra Ultra mount (Lab Vision,151 Fremont, CA, USA) ile kaplandı. Hazırlanan preparatlar Leica DM 4000B (Leica, Wettlar, GERMANY) mikroskop altında incelendi ve Leica QWin ProV 3.4.0 (Calidris and SoftHard Technology Ltd. Switzerland) ile fotoğraflandı.
     Apoptotik indeks (AI); kesitlerde 10'luk büyütmede ratgele seçilen alanlarda, normal ve apoptotik en az 500 hücre sayılarak apoptotik hücre yüzdesi hesaplanarak bulundu. Apoptotik hücreleri tanımlamada daha önce belirlenen kriteler kullanıldı (77). Ovaryan folliküller, ovaryan stroma, germinal epitelyum, uterusun endometriumu, endometrial glandlar incelendi. Her grupta incelenen bölgelerde apoptotik indeks (AI) değerlendirildi. İmmunohistokimyasal değerlendirme daha önce tanımlanmış olan, boyanmanın şiddetini ve yaygınlığını dikkate alan skorlama sistemi ile kullanıldı (78). "HScore" olarak tanımlanmış olan değer elde edilerek istatistiksel karşılaştırma yapıldı. Hscore, pozitif boyanan alanların toplam yüzdesinin, ağırlıklı olarak görülen boyanma intensitesinin bir fazlasıyla çarpılmasından elde edildi. şu şekilde formüle edebiliriz; HSCORE = _Pi(I+1), I boyanma yoğunluğunu (0=ekpresyon yok, 1=hafif, 2=orta, and 3=yoğun) ve Pi de boyanan alanların yüzdesini temsil etmektedir. Araştırıcılar arası taraflılığı önlemek için tüm preparatlar aynı uzman (N.L.) tarafından değerlendirildi.

İstatistiksel Analiz;
     İstatistiksel analiz için SPSS 15,0 for Windows kullanıldı. Verilerin normal dağılıma uygunluğuna Kolmogorov - Smirnov testi ile bakıldı. Normal dağılıma uyan bağımsız değişkenlerin değerlendirilmesinde grupları karşılaştırmak için tek yönlü varyans analizi kullanıldı, fark tespit edildiğinde farkı yaratan grubu bulmak için Bonferoni testi uygulandı. Normal dağılmayan değişkenlerin arasındaki fark açısından grupları karşılaştırmak için Kruskal Wallis varyans analizi kullanıldı. Fark tespit edildiğinde farkı yaratan grubu tespit etmek için gruplar ikili ikili Mann Whitney U test ile karşılaştırıldı. "p" değeri 0,05'in altında anlamlı olarak kabul edildi.

BULGULAR

     Hemotoksilen ile boyanan preparatlarda apoptotik indeks değerlendirildi.  Nükleer kondensasyon sonucu piknotik çekirdek içeren hücreler ve kondense eozinofilik stoplazmalı hücreler apoptotik hücreler olarak değerlendirildi. Grupların apoptotik indeks ortalama ve standart deviasyon değerleri tablo 1'de özetlendi.

Tablo 1: Grupların apoptotik indeks ortalama ve standart deviasyon değerleri.

(IMP: İmplanon (Etonogestrel) uygulanan grup, KONT.: Kontrol grubu,
SD: Standart deviasyon, Gland: Uterusun glandüler epiteli)

     Uterusa ait preparatlar incelendiğinde; endometriumda kontrol grubunda AI ortalaması 23,83±2,86 olarak gözlendi. Etonogestrel (Implanon(r), IMP) 10, 30 ve 50 gün uygulan ratların endometriumlarında AI ortalamaları 26,17±4,07, 27,17±6,34, 24±3,85 olarak izlendi ve bu değerler arasında istatistiksel olarak fark izlenmedi. Aynı zamanda kontrol grubu ile gruplar arasında fark izlenmedi (Tablo 1 ve Tablo 2).
     Uterus stromaları AI açısından değerlendirildiğinde; kontrol grubunun ortalama AI ortalama değeri 12,17±2,32 olarak izlendi. 10, 30 ve 50 gün IMP uygulanan ratların apoptotik indeks ortalama değerleri sırası ile 15,17±3,19, 33,17±4,96, 64±3,85 olarak izlendi. Bu grup içinde de süre bağımlı olarak AI değerleri artmış olarak izlendi. 10 gün uygulanan grup ile kontrol grubu arasında fark izlenmezken, 30 ve 50 gün uygulanan gruplar kontrol grubuna göre yüksek izlendi (Tablo 1 ve tablo 2).
     Uterus glandüler epitelleri AI açısından değerlendirildiğinde; kontrol grubunun AI ortalama değeri 16,17±2,32 olarak izlendi. IMP uygulanan gruplarda ise 10 gün uygulanan grubun AI ortalamalası 12,17±2,32 olarak izlendi. Kontrol grubu arasında fark izlenmedi. 30 ve 50 gün IMP uygulanan grupların ortalama AI değerleri sırası ile 30,17±3,71, ve 64±5,02 olarak izlendi. Bu değerler kontrol grubuna göre yüksekdi. 50 gün uygulanan grup bu iki gruptan daha yüksek izlendi (Tablo 1 ve Tablo 2).

Tablo 2: Dokulardaki apoptotik indeks değerleri açısından grupların ikili istatistiksel karşılaştırma sonuçları (p<0,05 anlamlı).

(IMP: İmplanon (Etonogestrel) uygulanan grup, KONT.: Kontrol grubu, Gland. Glandular hücreler)

     Ovaryan dokular AI açısından değerlendirildiğinde; granuloza hücrelerinde, kontrol grubunun AI ortalaması 8,17±0,98 olarak izlendi. 10, 30 ve 50 gün IMP uygulanan ratların granuloza hücrelerindeki AI ortalama değerleri sırası ile 22,17±3,19, 30,17±3,87 ve 65±4,65 olarak izlendi. Tüm değerler kontrol grubundan yüksek olarak izlendi. Maruziyet süresi arttıkça AI ortalama değerleri yükselmiş olarak izlendi (Tablo 1 ve tablo 2).
     Ovaryan dokular teka-lutein hücrelerdeki AI ortalamaları açısından değerlendirildiğinde; kontrol grubunun AI ortalama değeri 14,17±1,47 olarak izlendi. 10, 30  ve 50 gün IMP uygulanan grubun AI ortalama değerleri sırası ile 22,67±4,76, 30,17±3,99 ve 55±2,19 olarak izlendi. IMP uygulanan grupların teka-lutein hücrelerindeki AI ortalamaları arasında süre bağımlı olarak artış gözlendi (Tablo 1 ve Tablo 2). 
     Dokulardaki kaspaz 3 tutulumu immünhistokimyasal olarak incelenip, HScore değerleri her grup için değerlendirildi (Tablo 3).

Tablo 3: Grupların HScore ortanca ve minimum-maksimum değerleri.

(IMP: İmplanon (Etonogestrel) uygulanan grup, KONT.: Kontrol grubu,
Min-Max: Minimum-maksimum, Gland: Uterusun glandüler epiteli)

     Uterusta endometrium değerlendirildiğinde; kontrol grubunda ortanca HScore değeri 150(130-150) olarak izlendi. IMP gruplarında endometriumda HScore ortanca değerleri, 10 gün grubunda 140(120-160), 30 gün grubunda 180(100-250) ve 50 gün grubunda 180(140-270) olarak izlendi. 10 ve 30 gün grubunun kontrol grubu ile arasında anlamlı fark izlenmezken, 50 gün grubu ile kontrol grubu arasında anlamlı fark izlendi. Yine 10 ve 30 gruplarının birbirleri ile arasındaki fark anlamlı bulunmasa da bu gruplar ve 50 grubu farklı izlendi (Tablo 3 ve tablo 4). 
     Uterus stromasında HScore ortanca değerleri kontrol grubunda 10(10-30) olarak izlendi. IMP uygulanan gruplarda 10 gün grubunda HScore ortanca değeri 50(30-50), 30 gün grubunda 140(100-180) ve 50 gün grubunda 240(200-240) olarak tespit edildi. Tüm grupların HScore değerleri kontrol grubuna göre yüksek bulundu. 10 gün ve 30 gün grubu arasındaki fark istatistiksel olarak anlamlı olmamakla beraber 30 gün grubunda daha yüksek HScore tespit edildi. 50 gün grubunda daha yüksek HScore tespit edildi. 10 ve 50 gün grubundaki yükselme istatistiksel olarak anlamlı bulundu (Tablo 3 ve tablo 4). 
     Uterusun glandüler epitelyumunda HScore ortanca değerleri; kontrol grubunda 50(30-50). IMP grubunda 10, 30 ve 50 gün HScore ortanca değerleri sırası ile 40(30-80), 140(100-180) ve 200(160-240) olarak izlendi. 10 gün IMP uygulanan ratların HScore değerleri kontrol grubuna göre düşük izlendi fakat istatistiksel anlamlılık arz etmiyordu. IMP uygulanan ratlarda da glandüler hücrelerdeki HScore değerleri süre ile doğru orantılı olarak artış gösterdi (Tablo 3 ve tablo 4). 

Tablo 4: Overlerin teka-lutein hücrelerinin HScore değerleri açısından grupların ikili istatistiksel karşılaştırma sonuçları (p<0,05 anlamlı).

(IMP: İmplanon (Etonogestrel) uygulanan grup, KONT.: Kontrol grubu)

     Over dokuları immünohistokimyasal olarak kaspaz 3 tutulumu açısından değerlendirildiğinde; granuloza hücrelerinde kontrol grubunda HScore ortanca değeri 20(10-20) olarak tespit edidi. IMP grubu granuloza hücreleri HScore ortanca değerleri, 10 gün grubunda 80(60-100), 30 gün grubunda 180(140-180) ve 50 gün grubunda 400(360-400) olarak izlendi. Tüm grupların değerleri kontrol grubuna göre belirgin artmış olarak izlendi. Gruplar birbirleri ile karşılaştırıldığında,  10 gün grubu en düşük, 30 gün grubu daha yüksek ve 50 gün grubu en yüksek skorları alacak şekilde sıralandı. Süre bağımlı olarak bir immünrekativite artışı gözlendi (Tablo 3 ve tablo 4). 
     Over dokuları teka-lutein hücrelerdeki kazpaz 3 immünreaktivitesi açısından değerlendirildiğinde; kontrol grubu HScore ortanca değeri 100(80-100) olarak izlendi. IMP gruplarında teka-lutein hücrelerdeki HScore ortanca değerleri, 10, 30 ve 50 gün gruplarında sırasıyla 130(110-150), 200(140-270) ve 360(300-400) olarak tespit edildi. Tüm grupların skorları kontrol grubuna göre yüksek izlendi. Gruplar kendi içinde değerlendirildiğinde skorlardaki artış anlamlı bulundu (Tablo 3 ve Tablo 4). 

TARTIŞMA

     Normal gonadal gelişimde over ve testislerde somatik ve germ hücrelerin proliferasyonuna ek olarak, gonadal hücrelerin azalması da önemli bir fizyoloik rol oynamakta ve her iki cinste de germ hücrelerinin büyük çoğunluğunun kaybına neden olmaktadır.  Erkek ve kadın üreme fizyolojisinde apoptozisin önemli bir yeri vardır. Kadın gonadlarında folliküler gelişim esnasında yüksek oranda atrezi görülmekte (5) ve doğum esnasında mevcut olan folliküllerin %0,1'den azı ovüle olabilmektedir.  Atrezi, folliküllerde granuloza hücreleri apoptozisi ile hücresel düzeyde kontrol edilen bir işlemdir (6, 7, 8). 
     Özellikle memelilerde, ovaryan gelişim sürecinde masif olarak ovarian hücrelerin kaybının gözlendiği en az dört dejeneratif evre vardır. Birincisi primordial germ hücrelerinin yolk saktan genital kabarıntıya göçü sırasında izlenir (9, 10). İkincisi mayoza girişleri esnasında follikülleri oluşturmadan önce germ hücrelerinin atreziye gitmesi (11), üçüncüsü folliküler gelişimin sondan bir önceki aşamasında bir kısım folliküllerin atreziye gitmesi, dördüncüsü ise korpus luteum fonksiyonunu kaybederek atreziye gitmesidir (7).
     Atrezi tüm gelişim evrelerinde gözlenen bir süreçtir. Hormonlar, büyüme faktörleri ve sitokinler ile evre spesifik olarak kontrol altında tutulmaktadır (6, 12)
     Bazı çalışmalarda progesteronun granuloza hücrelerinde apoptozisi azalttığı gösterilmiştir (13).
     Çeşitli çalışmalarda, insanlarda ve ratlarda, progesteron stimulasyonunun özellikle periovulatuvar dönemde granuloza hücre sağ kalımı açısından önemli olduğu gösterilmiştir (14, 15). Yine statinler kullanılarak veya anti progesteron tedavilerle periovulatuvar granuloza hücre apoptozisinin arttığı gözlenmektedir (16).
     Klinik olarak progesteronlar, düşük tehditi, tekrarlayan gebelik kayıplarının önlenmesinde, preterm doğum tehditi ve asiste üreme teknikleri sonrası luteal destek amaçlı kullanılmaktadır. (17).
     Rat overleri incelendiğinde, kaspaz 3 aktivitesi folliküler ve luteal dokularda gözlenmiştir. Luteal hücrelerde, tekal hücrelerde ve az miktarda granuloza hücrelerinde kaspaz 3 immünreaktivitesi gösterilmiştir (18).  Fakat başka bir çalışmada da tekal hücrelerde kaspaz 3 immünreaktivitesi gösterilememekle beraber granuloza hücrelerinde ve luteal hücrelerde belirgin olarak gösterilmiştir (19). Yine gonadotropinlerin kaspaz 3 immünreaktivitesini azaltarak granuloza hücre canlılığının korumasında katkısı olduğu gösterilmiştir (18).  Fakat birçok çalışmada gonadotropin etkisi olmadığı dönemlerde de apoptozisin olduğu gösterilmiştir (19). Yine çalışmalarda kaspaz 3 aktivitesinin, germ hücrelerinde değilse bile granuloza hücreleri apoptozisinde gerekli olduğu gösterilmiştir (20).
     Folliküler gelişimin erken evrelerinde atrezi oosit apoptozisi ve bunu takip eden granuloza hücre ölümü ile olur (21). Maturasyon sürecinde ve matür folliküllerde ise apoptozis granuloza hücrelerinin apoptozisi ile başlar (22, 23).
     Bazı çalışmalarda anti progesteron tedavilerin apoptozisi granuloza hücrelerinde inhibe ettiği gösterilmişken(24), başka çalışmalarda yine granuloza hücrelerinde ve endometrial hücrelerde mifepristonun apoptozisi arttırdığı gözlenmiştir ( 15, 25).
     Endometriumda görülen siklik değişiklikler sırasında da hücre proliferasyonu ve apoptoozisin rolü vardır. Endometriumun çeşitli kompartmanlarında gözlenen apoptozis hormonal mekanizmalarla kontrol altına alınmaktadır. Çeşitli çalışmalar göstermiştir ki; endometrium glandlarında ve stromasında progesteron belirgin olarak apoptozisi arttırmaktadır. Stromada olmasa da endometriumun glanduler ve epitelyal kompartmanlarında östrojen varlığında progestron etki göstermektedir (26). 
     Progesteronların insan endometriumunda antiproliferatif etkisi in vivo ve in vitro olarak gösterilmiştir. Endometrial hiperplazisi olan kadınlara progesteron tedavisi verildikten sonra %60 oranında olumlu yanıt alınmasıyla klinik olarak da bu etki kanıtlanmıştır (27, 28). Aynı zamanda yüksek doz progesteron endometrial hiperplazi ve erken evre endometrium kanserinde de apoptotik etkisi ile tedavi edici niteliktedir (26 ).
     Literatürdeki diğer çalışmalardan farklı olarak, bu çalışmada progesteron uygulaması oral değil implant yoluyla yapılmıştır. Oral yapılan uygulamalarda ratların yemine ilaç katılmakta ve uygulanan progesteron dozu monitörize edilememektedir. Diğer bir yöntem ise orogastrik yolla ilaç verilmesidir. Bu yöntemde de morbidite ve mortalite artmakla beraber, rat için sürekli bir stres faktörü oluşturulmaktadır. Bu da özellikle hormon bazlı çalışmalarda sonuçları etkileyebilmektedir. İmplant veya depo formlarda ise salınan ilaç dozu sabit olup kandaki progesteron miktarı garanti edilebilmektedir. Ayrıca sadece implantın yerleştirildiği gün akut bir stres maruziyeti vardır. Literatürden diğer farklı yanı ise progesteronun süre bağımlı etkisinin ortaya konulmaya çalışılmış olmasıdır.  
     Overlerde yaşamın erken evrelerinden itibaren, gerek somatik hücrelerde gerek oositlerde sürekli bir yıkım ve hücre kaybı olduğu bilinmektedir. Bu süreçteki anormallikler gonad fonksiyonlarındaki bozukluklara, prematür ovaryan yetmezlikten infertiliteye kadar kadın hayatını etkileyen ciddi problemlere neden olabilmektedir. Ovaryan fonksiyonu belirleyen temel faktörler genetik ve çevreseldir. Çevresel faktörlerin bir bölümünü de uygulanan medikasyonlar oluşturmaktadır. Her ne kadar verilen tedavilerde olabildiğince fizyolojik koşullar yaratılmaya çalışılsa da (özellikle yardımcı üreme tekniği uygulamalarında) iyatrojenik olarak uygulanan medikasyonların bazılarının etkileri net olarak bilinmemektedir. Hayvan modelleri ile yapılan çeşitli histolojik çalışmalar bu konuda faydalı olabilmektedir.
     Günümüz tıbbında organ koruyucu ve minimal invaziv tedaviler ön plandadır. Bu nedenle geçmişte yaygın olarak kullandığımız teknikler terk edilmiş veya modifiye edilmiştir. Uzun dönem etkileri gözlenen bir kısım medikasyonlar terk edilmiştir.
     Çalışmamızda yaygın olarak kullanılan progesteronlar tercih edilmiştir. Bu ilaçların hedef organlarda veya diğer dokularda majör yan etkilerinin olmadığı varsayılmaktadır.
     Bizim çalışmamızda, overler incelendiğinde granuloza hücrelerinde ve luteinize hücrelerde kaspaz 3 immünreaktivitesinin progesteron uygulamasıyla süre ile bağımlı olarak belirgin olarak arttığı gözlemlenmiştir. Bu da hücrelerdeki apoptozisin, progesterona maruz kalınan süreyle korele olarak arttığı anlamına gelmektedir. Rat hayatı yaklaşık olarak 2,5-3 senedir. Hayatlarının bir ayı insan yaşamının 2-3 yılına karşılık gelmektedir. Buradan yola çıkılarak yapılabilecek bir kıyaslama ile yaklasık olarak bir yıl ve üstünde progesterona maruziyet sonucu overlerde somatik hücrelerde apoptoziste bir artış gözlenebileceği sonucuna varılabilir. Bu artış 2-3 yıl sonra daha belirgin bir hal alabilmektedir. Literatüre baktığımızda; fizyolojik koşullarda apoptozis varlığı çeşitli çalışmalarda gözlemlenmiştir. Progesteron etkisi incelendiğinde çoğu çalışmada progesteronun apoptozdan koruyucu etki göstermesine ve antiprogestin medikasyonun apoptozisi arttırıcı etkisi gözlenmesine karşın bununla çelişen veriler de mevcuttur (13). Çalışmamızdaki süre bağımlı apoptotik etkiyi oluşturan temel nedenin progestinlerin meydana getirdiği androjenik etkiye uzun süreli maruziyet olduğu düşülmektedir. İhmal edilebilecek boyutta görülen bu yan etki uzun süreli kesintisiz maruziyette kümülatif bir etki yaratmış olabilir. Aynı zamanda progestronun seks hormonu bağlayıcı globülin seviyelerini azaltmasına bağlı olarak da androjenik etki potansiyelize olmaktadır. Androjenlerin ovaryan hücrelerdeki apoptotik etkisi bilinmektedir. Ayrıca kronik ve sürekli progesteron maruziyeti gonadotropin süpresyonuna neden olmaktadır. Gonadotropinlerin uzun süreli yokluğu da ovaryan hücreler için önemli bir koruyucu faktörün kaybolması anlamına gelmektedir. Koruyucu ve yıkıcı hormonal faktörler arasındaki dengenin değişmesi overlerdeki sonuçları elde etmemize neden olmaktadır.
     Endometrium üzerinde ise etki daha farklı bir boyuttadır. Embriyonel gelişim açısından aynı kökenden gelmekle beraber (29) progesteronun endometriumun üzerine etkisi overlerden farklılık göstermektedir. Endometrium hormonal değişiliklere yanıt veren dinamik bir dokudur. Progesteron da endometriumun cevap verdiği temel hormonal uyaranlardan biridir. Bu yanıt çeşitli çalışmalarla gösterilmiş ve özellikle disfonksiyonel uterin kanama, endometrial hiperplazi ve erken evre endometrium kanseri gibi patolojilerde kullanılmıştır. Bizim çalışmamızda da endometrium incelenmiş, stroma ve glandüler hücrelerde süre bağımlı olarak apoptozisin belirgin arttığı, epitelde belirgin bir değişiklik olmadığı gözlenmiştir. Bu veriler literatürle uyumlu olarak gözlenmiştir. Bu etki progestinlerin direkt etkisidir.
     Literatürde, progestinlerin süre bağımlı olarak etkinliğini, endometrial hiperplazi veya erken evre endometrium kanserinde ortaya koyan çalışma izlenmemektedir (30). Çeşitli yayınlarda endometrial hiperplazi ve endometrium kanserinde, progesteron tedavisine rağmen progresyon oranları çok geniş bir aralıkta (%0-%60, %10-%100), değişken olarak izlenmiştir (31). Bu yayınlar uygulama süreleri açısından standardize edilmediği için cevapsız olarak gözlenen bir kısım hastada, tedavi süresinin uzatılması ile başarı elde edilebileceği hipotezi çalışmamız ışığında akla gelmektedir. Düzenlenecek klinik çalışmalarla bu yayında elde edilen bulgular klinikte, insanlar üzerinde test edilmelidir. Paralel bulgular saptanırsa progesteron tedavisinin endometrial patolojilerin tedavisindeki etkinliği netleşmiş olacak ve önemi artacaktır.
     Çalışmamızdaki veriler de göstermektedir ki; progesteronların endometrium üzerindeki koruyucu etkisi net olmakla beraber, özellikle sistemik uygulamalarda bu hormonların uzun süreli kullanımı sonucu overlerde fonksiyonları etkileyebilecek bir etki görülebilmektedir. Bu yüzden kullanıldığı yaş grubu dikkate alınarak, ki kimi zaman progesteronlar endometrial hiperplazi veya erken evre endometrium kanserinde ferilite koruyucu olarak veya uzun süreli kontrasepsiyon amaçlı kullanılmaktadır, over fonksiyonlarına uzun dönemde olabilecek yan etkiler de göz önünde bulundurularak lokal uygulamalar sistemik uygulamalara tercih edimelidir. şüphesiz ki bu tür uygulamalarda sistemik etki minimale indirilebilmektedir. Kontrasepsiyon açısından bakıldığında da "siklik rejimler daha mı fizyolojik?" sorusunu akıllara getirmektedir. Apoptotik etki ve de gerek depo, gerekse implant formlarından sonra fertilitenin geç geri dönüşü hesaba katılırsa toplam fertil sürenin kümülatif olarak azalmış olabileceği düşünülebilir. Bu da sosyal yaşam koşulları sonucu ilerlemiş olan doğurganlık yaşının etkisiyle birleştiğinde fertilite problemleri oluşturabilmektedir.

KAYNAKLAR

1-  Raff MC. Social controls on celi survival and celi death. Nature. 1992: 356:397-400.
2-  Ellis RE, Yuan JY, Horvitz HR. Mechanisms and functions of celi death. Annu Rev CellBiol. 1991;7:663-98.
3-  Ameisen JC, Estaquier J. Idziorek T. De Beis F. Programmed celi death and AİDS pathogenesis: significance and potential mechanisms. Curr Top Microbial Immunol. 1995;200:195 - 211.
4-  Dragunow M, MacGibbon GA, Lawlor P, et al. Apoptosis, neurotrophic factors and neurodegeneration. Rev, Neurosci. 1997:8:223-65.
5-  Gougeon A. Dynamics of follicular growth in the human: Amodel from preliminary results. Hum Reprod 1986:1:81 - 87
6-  Hsueh AJ, Billig H, Tsafriri A. Ovarian follicle atresia: A hormonally controlled apoptotic process. Endocr Rev  1994:15:707-724.
7.  Billig H, Chun SY, Eisenhauer K and Hsueh AJW. European Society for Human Reproduction and Embryology Gonadal cell apoptosis: hormone-regulated cell demise. Human  Reproduction Update 1996:2:103-117.
8-  Kaipia A, Hsueh AJ. Regulation of ovarian follicle atresia. Annu Rev Physiol 1997:59:349-363.
9-  Dolci, S, Williams DE, Ernst MK,  Resnick JL, Brannan CI,  Lock LF et al. Requirement for mast cell growth factor for  primordial germ cell survival in culture. Nature 1991:352,809 - 811.
10-  Godin, I., Deed, R., Cooke, J., Zsebo, K., Dexter, M. and  Wylie, C.C.  Effects of the Steel gene product on mouse primordial germ cell culture. Nature 1991:352, 807-809.
11-  Beaumont, HM, and Mandl, AM. A quantitative and cytological study of oogonia and oocytes in foetal and  neonatal rat.Proc. R. Soc. Lond., Ser. B, 1962:155:557-579.
12-  Markstro'm E, Svensson EC, Shao R, Svanberg B, Billig H.. Survival factors regulating ovarian apoptosis-dependence  on follicle differentiation. Reproduction 2002:123:23-30.
13- Rodriguez GC, Nagarsheth NP, Lee KL, Bentley RC, Walmer DK, Cline M et al. Progestin-induced apoptosis in the Macaque ovarian epithelium: differential regulation of transforming growth factor-beta. J Natl Cancer Inst.  2002:2;94(1):50-60
14- Svensson EC, Markstro'mE, Andersson M, Billig H. Progesterone receptor-mediated inhibition of apoptosis in  granulosa cells isolated from rats treated with human  chorionic gonadotropin. Biol Reprod 2000:63:1457-1464.
15-  Svensson EC, Markstro'mE, Shao R, Andersson M, Billig  H. Progesterone receptor antagonists Org 31710 and RU 486 increase apoptosis in human periovulatory granulosa cells. Fertil Steril 2001:76:1225-1231.
16-  Rung E, Friberg PA, Bergh C, Billig H. Depletion of substrates for protein prenylation increases apoptosis in human periovulatory granulosa cells. Mol Reprod Dev.  2006;73:1277-83.
17-  Di Renzo GC, Mattei A, Gojnic M, Gerli S. Progesterone  and pregnancy. Curr Opin Obstet Gynecol 2005;6:598 - 600.
18-  Boone DL and Tsang BK. Caspase-3 in the Rat Ovary: Localization and Possible Role in Follicular Atresia and Luteal Regression. Biol. Reprod. 1998:58:1533-1539
19- Tilly JL, Pru JK, Rueda BR. Apoptosis in ovarian development, function, and failure. In: The Ovary, edited  by Leung PCK and Adashi EY. San Diego, CA: Elsevier/Academic, 2004:321-352.
20-  Fenwick MA and Hurst PR. Immunohistochemical localization  of active caspase-3 in the mouse ovary: growth and atresia of small follicles. Reproduction 2002:124, 659-665.
21-  Rung E, Friberg PA, Shao R, Larsson DG, Nielsen ECh, Svensson PA et al. Progesterone-receptor antagonists and statins decrease de novo cholesterol synthesis and increase apoptosis in rat and human periovulatory granulosa cells in vitro. Biology of Reproduction 2005;72:538-45.
22-  Makino A, Ozaki Y, Matsubara H, Sato T, Ikuta K, Nishizawa Y et al. Role of apoptosis controlled by cytochrome c released from mitochondria for luteal function in human granulosa cells. American Journal of Reproductive Immunology 2005;53: 144-52.
23-  Vitale AM, Abramovich D, Peluffo MC, Meresman G, Tesone  M. Effect of gonadotropin-releasing hormone agonist and  antagonist on proliferation and apoptosis of human. Fertil  Steril. 2006:85(4):1064-7.
24-  Zhang W, Huang L, Zhuang Y, Wang W. The effect of mifepristone on apoptosis and caspase-3 activation in human ovarian uteinized granulosa cells. Eur J Obstet Gynecol Reprod Biol. 2008;141(2):131-6.
25-  Han S, Sidell N. RU486-induced growth inhibition of human endometrial cells involves the nuclear factor - kappa B signaling pathway. Journal of Clinical Endocrinology Metabolism 2003;88:713-9.
26-  Rodriguez GC, Rimel BJ, Watkin W, Turbov JM, Barry C,  Du H et al. Progestin treatment induces apoptosis and  modulates transforming growth factor-beta in the uterine endometrium.Cancer Epidemiol Biomarkers Prev. 2008;17(3):578-84.
27-  Gal D. Hormonal therapy for lesions of the endometrium. Semin Oncol 1986;13:33- 6.
28-  Ferenczy A, Gelfand M. The biologic significance of cytologic atypia in progestogen-treated endometrial hyperplasia. Am J Obstet Gynecol 1989;160:126-31.
29- Kurman RJ, editor. Blaustein's pathology of the female  genital tract. 5th ed. New York: Springer-Verlag; 2002.
30-  Reed SD, Voigt LF, Newton KM, Garcia RH, Allison HK,  Epplein M, Jordan D, Swisher E, Weiss NS. Progestin  therapy of complex endometrial hyperplasia with and without  atypia. Obstet Gynecol. 2009 Mar;11. 3(3):655-62.
31-  Randall TC, Kurman RJ. Progestin treatment of atypical  hyperplasia and well-differentiated carcinoma of the endometrium in women under age 40. Obstet Gynecol 1997;90:434-40.

Yazışma Adresi:   
Dr. Nicel TAŞDEMİR
Dr. Zekai Tahir Burak Kadın Sağlığı Eğitim ve Araştırma Hastanesi
 Hamamönü / ANKARA
Tel: 0 312 310 31 00
e-mail: This e-mail address is being protected from spambots. You need JavaScript enabled to view it