“Apoptosis and Cospose System”
Dr. Beril YÜKSEL, Dr. Sevtap HANDEM‹R KILIÇ, Dr. Nicel TAŞDEMİR, Dr. Sertaç BATIOĞLU

Özet
       
Apoptozis, doku homeostasisinden sorumluprogramlı hücre ölümlüdür. Kapsaz adı verilen intrasellüler proteazlar, apoptozisin morfolojik ve biyokimyasal değişikliklerinden sorumludur. Kaspszlar yapılarına ve substrat spesifitelerine göre gruplandırılabilir. Bu proteazlardan oluşan hücre içi kaskadın çeşitli yollarla aktive edilmesinin ardından, yapısal proteinlerin sindirimi, kromazamal DNA'nın degredasyonu ve hücrenin fagositozu sağlanır.
Anahtar Kelimeler: Apoptozis, kaspsaz sistemi

Summary
       
Apoptosis is the programmed cell death wich has a critical role for tissue homeostasis. The intracellular proteases, caspases, are responsible for the morphological and biochemical changes during apoptosis. The caspases can be grouped according to their stuctures and subsrate specifities. After the activition of intracellular cascade of these proteases, digestion of structural proteins, degradation of chromosomal DNA and phagocytosis of the cell take place.
Key Words: Apoptosis, Caspase system

     Apoptozis, organizma tarafından düzenlenen enerji bağımlı hücre ölümüdür. Programlı hücre ölümü olarak da adlandırılan bu süreç, doku homeostazının korunmasında kritik bir role sahip olduğu gibi, fetal gelişim ve erişkin dokulardaki pekçok fizyolojik olayda da önemli rollere sahiptir. Apoptozis terimi ilk kez 1972 yılında Kerr ve arkadaşları tarafından kullanılmıştır (1). Kerr, fizyolojik olarak ölen hücrelerin çekirdeklerinde yoğunlaşmış kromatin parçalarını gözlemlemiş ve organellerin iyi korunduğunu fark ederek bu olayı büzüşme nekrozu olarak adlandırmıştır. Apoptosis terimi köken olarak "ayrı düşmek" anlamına gelmektedir (1). ve hücre kaybını belirtmek amacı ile kullanılmıştır.
     Apoptotik ölüm sinyali alan hücrenin kromatini yoğunlaşmaya başlar. Benzer şekilde sitoplazma da yoğunlaşmaya ve hücrenin boyutları küçülmeye başlamıştır. Bir süre sonra hücre apoptotik cisimcik denilen daha küçük parçalara bölünür. Bu parçacıkların en büyük özelliği, fragmente olmuş nükleusların ve parçalanan hücreye ait tüm yapıların plazma membranı ile kaplanarak immün sistemi enflamasyon yönünde uyarmamasıdır. Apoptotik cisimcikler, yüzeylerinde yeni sinyal yapıları ortaya çıkarır ve bu sinyalin uyarısı ile yandaki hücre tarafından fagosite edilerek ortadan kaldırılır (2,3).
     Apoptozis normal gelişimsel süreç içerisinde pek çok fizyolojik olayda görev alır. Embriyogenesis (4,6), normal menstruel siklusda endometrial hücrelerinin yıkımı (5), barsak kripta epitelleri gibi sürekli çoğalan hücre gruplarında hücre sayısının dengelenmesi (6), timusun gelişimi sırasında otoreaktif T hücrelerinin ortadan kaldırılması (6), bunlardan sadece birkaçıdır. Apoptotik hücre ölümü regülasyonundaki defektler hücre birikiminin olduğu kanser, restenoz gibi hastalıklara yol açabildiği gibi, hücre yıkımının arttığı otoimmün rahatsızlıklar, nörodejeneratif hastalıklar, Alzheimer gibi rahatsızlıklara da yol açabilmektedir (7,8 ).
     Son yıllarda yürütülen araştırmalar neticesinde, apoptosisten sorumlu moleküler mekanizmalar açıklığa kavuşmuştur. Bu çalışmalar sonucunda, kaspaz adı verilen, intrasellüler proteazların; apoptosisin gerek  direkt, gerekse indirekt morfolojik ve biokimyasal değişikliklerinden sorumlu olduğu ortaya konulmuştur. Kaspazların apoptozla ilk ilişkisi bir nematod olan Caenorhabditis Elegans'ın genetik analizi sırasında ortaya çıkmıştır (9).
     Kaspazlar apoptotik hücre ölümü esnasında önemli rol oynayan multigen ailesinden oluşan sistein-proteaz grubu enzimlerdir. Kelime olarak "Cysteine Aspartate Specific ProteASEs- CASPASE" olarak türetilmiştir. Öncelikle inaktif proteinler olarak sentezlenen bu enzimler çeşitli yollarla aktive edilmelerinin ardından hücresel hedeflerdeki tetrapeptit motifleri tanır ve substratı, bir aspartat rezidüsünün karboksil tarafından ayırır. Hücre ölümü sırasında meydana gelen pek çok sellüler ve morfolojik değişimler, bu enzimlerin rol oynadığı birtakım süreçler neticesinde gelişir (10).
Kaspaz-1, kaspaz ailesinin prototipidir ve önceleri prointerlökin-1-beta'nın biyolojik aktif formuna dönüşümünden sorumlu, ICE (interlökin-1-beta dönüştürücü enzim) olarak da adlandırılan, bir sistein proteaz olarak tanımlanmıştır (11,12). Daha sonraları ise ICE'nin diğer sistein-proteazlardan farklı olarak amid bağının N-terminalindeki p1 pozisyonu olarak bilinen ucunda aspartik asitin mutlak gerekliliğini gerektiren farklı bir sistein-proteaz olduğu keşfedilmiştir.
     ICE'nin inflamasyondaki rolü geniş bir şekilde aydınlatılırken bir taraftan da hücre ölümünden sorumlu genetik yoldaki rolü ortaya konmuştur (13). Bir nematod olan Caenorhabditis elegans'ın üzerinde yapılan bu çalışmada, hücre ölümü sırasında görev alan genetik yolda ced-3 isimli bir genin kodladığı proteinin hermafroditin gelişimi esnasındaki tüm programlı hücre ölümlerinden sorumlu olduğu görülmüştür. Daha sonraları ise ced-3'ün memelilerdeki ICE'nin bir homoloğu olduğu gözlenmiştir (14,15). Tüm bu bilgilerin ışığında apoptotik hücre ölümleri esnasında meydana gelen özellikli proteolizler ve bu yıkımlar sonucu oluşan biyokimyasal olaylar aydınlatılmaya çalışılmıştır.
     Memelilerde en az 14 kaspaz tanımlanmıştır (16). Filogenetik analiz sonucunda gen ailesinin ICE (kaspaz-1) ile ilişkili ve ced-3 benzeri olmak üzere iki subgrubu olduğu görülür. Proenzimlerin kısa (kaspaz 3,6,7) veya uzun prodomain barındırmalarına göre de kaspazları daha alt gruplara ayırmak mümkündür. Alternatif olarak bu proteazlar, substrat spesifitelerine göre de gruplandırılabilir (17,18). Günümüzdeki modern yaklaşım ise proteazları üç gruba ayırmaktadırlar (10). (şekil-1).

Şekil 1: Proteolitik aktivitelerine göre kaspazlar

Grup 1 : Sitokin matürasyonuna aracılık edenler (caspase-1, 4, 5, 13) - ICE ailesi,
Grup 2 : Apoptotik hücre ölümü sürecinde efektör görevi üstlenenler (kaspaz-2, 3, 7) - ced 3 ailesi,
Grup 3 : Apoptotik hücre ölümünde aktivatörler (kaspaz-6, 8, 9, 10) -  ced 3 ailesi (14).

     Kaspazlar tetrapeptit motiflerini aminoasit spesifitelerine göre tanır ve p4 pozisyonundaki aminoasitlere göre üç spesifik gruba ayrılır. Grup 1 kaspazlar (kaspaz-1, 4, 5, 13) P4 pozisyonunda hidrofobik aminoasitleri tanırlar ve sitokinlerin maturasyonuna aracılık ederler. Grup 2 kaspazların yeğledikleri ayırma noktası hücre ölümü sırasındaki pek çok proteinlerde gözlenir ve bununla ilintili olarak da grup 2 kaspazlar (kaspaz-2, 3, 7) apoptosisin major efektörleri olarak bilinirler. Grup 3 kaspazlar (kaspaz-6, 8, 9, 10) ise P4 pozisyonunda alifatik aminoasitleri tanır ve grup 2 kaspazların aktivasyonunda görev alır (şekil 2). Kaspazlara ek olarak bir serin proteaz olan granzim-B gibi başka proteazlar da kaspaz aktivasyonunda görev alarak ve bazen de kaspazların yerine fonksiyon görerek apoptotik hücre ölümüne katkıda bulunur (şekil 2).

Şekil 2: Kaspazların moleküler sıralanımı (10).

     Bu sıralanmanın istisnaları da mevcuttur. Örneğin kaspaz-2 kendiliğinden aktive olabilir. Kaspaz-6 efektör proteaz olarak görev alabilir (10).
     Kaspazlar inaktif üç parçalı proenzimler olarak sentez edilirler. Aktivasyonları sırasında aspartat (P1) - X (P2) bağının ayrılması ile proenzimden, küçük ve büyük subüniteleri içeren aktif enzim oluşur. Ayrılma noktasında aspartatın bulunması kaspazın oto-aktif ya da aktive edilebilir olmasıyla uyumludur. Ayrılma işleminden sonra 2 büyük ve 2 küçük alt üniteden oluşan tetramer yapısına sahip kaspaz yapısı izlenir (şekil 3).

Şekil 3: Kaspaz X-ışını kristal yapılanması.

     Kaspazların tetramer yapısı 2 adet büyük (dışta) ve 2 adet küçük alt üniteden (içte) oluşmuştur. Bu şekilde kaspaz-3 ve onun inhibitörü Ac-DEVD-CHO (sarı) görülmektedir (24).

     Kaspaz aracılı apoptozisin aktivasyonunda üç ayrı yolun varlığı bilinmektedir;

     1. Mitokondri/Sitokrom-C aracılı apoptozis
     2.  Hücre yüzey reseptörleri aracılığı ile tetiklenen apoptozis
     3. Endoplazmik retikulum aracılı apoptozis

1. Mitokondri/Sitokrom-C aracılı Apoptozis:
     Hücresel stres durumunda mitokondriden, sitokrom c ve apoptotik proteaz aktive edici faktör (Apaf-1) salınarak dATP kofaktörlüğünde prokaspaz-9 molekülüne bağlanır (şekil 4). Bu yolla aktive olan kaspaz-9, prokaspaz-3'ü aktive eden kaskadı başlatır ve devamında sitoplazmada yapısal poteinlerin sindirimi, kromozomal DNA'nın degradasyonu ve hücrenin fagositozu sağlanır (19,20,21).

Şekil 4: Sitokrom c ve Apaf-1 aracılı apoptozis

     Apaf-1 molekülündeki konformasyonel değişiklikler apoptozom oluşumuna ve apoptozisin aktivasyonuna neden olur. Apoptozomun oluşum ve fonksiyon görmesi ise mitokondrial ve sitozolik faktörler tarafından düzenlenir (22).

2. Hücre yüzey reseptörleri aracılığı ile tetiklenen apoptozis:
     Fas-ligand (Fas-L) ve Tumor necrosis factor (TNF) gibi moleküllerin, hücre yüzeyindeki Fas ve TNF reseptörlerine bağlanmasıyla sitoplazmaya Kaspaz-8'i aktive eden sinyaller yayılır.
     Kimyasal, fiziksel ya da viral enfeksiyonlarla hasar görmüş hücrelerde, interlökin-1 (IL-1) gibi pro-enflamatuar sitokinlerin etkisi ile hücre yüzey Fas ekspresyonu başlar. Bu süreç Fas antijeninin up-regülasyonu olarak adlandırılır. Bu süreç sırasında sitotoksik T hücreleri de Fas-L yapımı için uyarılırlar ve Fas- FasL bağlanması ile prokaspaz 8 ve 2'nin aktivasyonu sağlanır (23).  Böylece hücrenin apoptozise gitmesi indüklenmiş olur (24). Fas-Fas-L etkileşimi FADD (Fas bağımlı ölüm domain proteini) aracılığıyla olur (25) (şekil 5).
     Bir yandan da, ilk kez granülositlerde keşfedildiği için Granülosit-enzim kelimelerini birleştirerek ifade edilen Granzim B (GrB), sitotoksik T hücrelerinden salgılanarak GrB reseptörlerine bağlanır. GrB bir serin proteaz enzimidir. Sitoplazma içine alınan GrB, kaspas kaskadı üzerinden apoptozisi başlatır (26,27,28,29).

3. Endoplazmik retikulum aracılı apoptozis:
     Endoplazmik retikulum (ER), hücre içi kalsiyum dengesi, sentezi ve membran proteinlerinin katlanmasını içeren birçok süreçte kritik öneme sahiptir. Hücre içi kalsiyum seviyeleri yükseldiğinde ER membranında lokalize olan prokaspaz-12 aktifleşir ve sitoplazmaya yönelir. Kaspaz-9 ile karşılıklı olarak etkileşerek kaspaz kaskadını aktive eder (30,31). 
     Kaspasların etkilediği hedef noktalar; DNA hasarının tamirinden sorumlu Poli ADP Riboz Polimeraz (PARP) (9,32), DNA-bağımlı protein kinaz (DNA-PK) (33,34), nükleus membranının integritesini sağlayan laminler (35) ve UlRNP (9), DNA'nın parçalanmasına yol açan nükleazları inhibe eden DNA fragmentasyon faktörü (DFF 45) adlı protein (36), hücre içi kolesterol homeostazisinden sorumlu bir integral protein olan Sterol Düzenleyici Element Bağlayıcı Protein (SREBP-1) (16-37), bir tümör supresör gen olan retinoblastom geni ve hücre iskelet proteinlerinden Fodrin (23) olarak özetlenebilir.
     Apoptozisi saptamak icin çok çeşitli yöntemler geliştirilmiştir. 1972 yılında, apoptozis terimi ilk kez kullanıldığında hücrenin morfolojik görünümüne göre karar verilmişti. Günümüzde ise morfolojik değerlendirmenin yanı sıra, apoptozise özgü olduğu bilinen bazı aktivasyonların (örn, aktif kaspaz-3 tayini) moleküler düzeyde belirlenmesiyle de apoptosiz saptanabilmektedir. Bu yöntemler şu şekilde sıralanabilir (38):

I. Morfolojik görüntüleme yöntemleri
 1. Işık Mikroskobu
•  Hematoksilen Boyama
•  Giemsa Boyama
 2. Floresan Mikroskobu / Lazerli Konfokal Mikroskop
 3. Elektron Mikroskobu 
 4. Faz Kontrast Mikroskobu

II. İmmunohistokimyasal yöntemler
 1. Anneksin V Yöntemi
 2. Tunnel Yöntemi
 3. M30 Yöntemi
 4. Kaspaz 3 Yöntemi

III. Biyokimyasal yöntemler
 1. Agaroz Jel Elektroforezi
 2. Western Blot
 3. Flow Sitometri

III. İmmunolojik yöntemler
 1. Elisa
 2. Flourimetrik Yöntem

IV. Moleküler Biyoloji yöntemleri (DNA Microarrays)

     Günümüzde pekçok çalışmada bu yöntemlerden bir veya birkaçından birlikte faydalanıldığı ve gerek  çeşitli çevresel toksinlerin gerekse birtakım hastalıkların dokulardaki etkisini göstermek amacıyla kullanıldığını görmekteyiz.

KAYNAKLAR

1. Kerr J.F., Wyllie A.H, Currie A.R. Apoptosis: a basic biological phenomenon with wide ranging implications in tissue  kinetics. Br J Cancer 1972; 26 (4): 239-245.
2.  Lipponen P, Aaltomaa S, Kosma VM, Syrjänen K. Apoptosis in breast cancer as related to histopathological characteristics and prognosis. Eur J Cancer. 1994; 30A(14): 2068-73.
3.   Wyllie AH, Kerr JF, Currie AR. Cell death: the significance of apoptosis. Int Rev Cytol. 1980;68:251-306.
4.  Majno G, Joris I. Apoptosis, oncosis, and necrosis. An overview of cell death. Am J Pathol. 1995 Jan;146(1):3-15
5.  Hopwood D, Levison DA. Atrophy and apoptosis in the cyclical human endometrium. Pathol. 1976 Jul;119(3):159-66.
6.  Cohen JJ. Apoptosis: mechanisms of life and death in the immune system. J Allergy Clin Immunol. 1999  Apr;103(4):548-54.
7.  Kiess W, Gallaher B. Hormonal control of programmed cell death/apoptosis. Eur J Endocrinol. 1998 May;138(5):482 - 91.
8.  Hetts SW. To die or not to die: an overview of apoptosis and its role in disease. JAMA. 1998 Jan 28;279(4):300-7.
9.  Nicholson DW, Thornberry NA. Caspases: killer proteases. Trends Biochem Sci. 1997 Aug; 22(8):299-306.
10.  Nicholson DW. Caspase structure, proteolytic substrates, and function during apoptotic cell death. Cell Death Differ 1999; 6:1028-1042.
11.  Thornberry NA, Bull HG, Calaycay JR, Chapman KT, Howard AD, Kostura MJ, et al. A novel heterodimeric cysteine  protease is required for interleukin-1 beta processing in monocytes. Nature 1992; 356: 768 - 774.
12.  Cerretti DP, Kozlosky CJ, Mosley B, Nelson N, Van Ness  K, Greenstreet TA, et al. Molecular cloning of the interleukin1 beta converting enzyme. Science 1992; 256: 97 - 100.
13.  Ellis RE, Yuan JY and Horvitz HR. Mechanisms and functions of cell death. Annu. Rev. Cell. Biol. 1991; 7: 663 - 698
14.  Xue D, Shaham S and Horvitz HR. The Caenorhabditis  elegans celldeath protein CED-3 is a cysteine protease  with substrate specificities similar to those of the human CPP32 protease. Genes. Dev. 1996; 10: 1073 - 1083
15.  Yuan J, Shaham S, Ledoux S, Ellis HM and Horvitz HR. The C. elegans cell death gene ced-3 encodes a protein similar to mammalian interleukin-1 beta-converting enzyme. Cell  1993; 75: 641 - 652
16.  Alnemri ES, Livingston DJ, Nicholson DW, Salvesen G, Thornberry NA,Wong WWand et al. Human ICE/CED-3 protease nomenclature. Cell 1996; 87 (2): 171
17.  Thornberry NA, Rano TA, Peterson EP, Rasper DM, Timkey T, Garcia-CalvoM, et al. A combinatorial approach defines specificities of members of the caspase family and granzyme  B. Functional relationships established for key mediators  of apoptosis. J. Biol. Chem. 1997; 272: 17907 - 17911.
18.  Rano TA., Timkey T., Peterson EP., Rotonda J., Nicholson DW., Becker JW., et al. A combinatorial approach for determining protease specificities: application to interleukin-1beta converting enzyme (ICE). Chem. Biol. 1997; 4: 149 - 155.
19.  Hu Y M, Benedict M A, Ding L Y. Role of cytochrome c and dATP/ATP hydrolysis in Apaf-I-mediatcd caspase-9 activation and apoptosis. EMBO J. 18: 3586- 3595, 1999.
20.  Krajewski S, Krajewska M, Ellerby L M, Welsh K, Xie Z, Deveraux Q L, Salvesen G S, Bredesen D E, Rosenthal R  E, Fiskum G, Reed J C: Release of caspase-9 from mitochondria during neuronal apoptosis and cerebral  ischemia. Proc Natl Acad Sci, USA 96: 5752-5757, 1999.
21.  Li P, Nijhawan D, Budihardjo I, Srinivasula SM, Ahmad M, Alnemri ES et al. Cytochrome c and dATP-dependent formation of Apaf-1/caspase-9 complex initiates an apoptotic protease cascade. Cell 1997; 91: 479 - 489
22.  Cozzolino M, Ferraro E, Ferri A, Rigamonti D, Quondamatteo F, Ding H, Xu ZS, Ferrari F, Angelini DF, Rotilio G, Cattaneo E, Carrì MT, Cecconi F. Apoptosome inactivation rescues proneural and neural cells from neurodegeneration. Cell  Death Differ. 2004 Nov;11(11):1179-91.
23.  Nagata S, Golstein P. The Fas death factor. Science. 1995; 267:1449-56.
24.  Grell M, Krammer PH, Scheurich P. Segregation of APO- 1/Fas antigen- and tumor necrosis factor receptor-mediated apoptosis. Eur J Immunol. 1994 Oct; 24(10): 2563-6.
25.  Bhojani MS., Chen G., Ross BD., Beer DG., Rehemtulla A. Nuclear localized phosphorylated FADD induces cell proliferation and is associated with aggressive lung cancer.  Cell Cycle. 2005 Nov;4(11): 1478-81. Epub 2005 Nov 20.
26.  Srinivasula SM., Ahmad M., Fernandes-Alnemri T., Litwack G., Alnemri ES. Molecular ordering of the Fas-apoptotic  pathway: the Fas/APO-1 protease Mch5 is a CrmA-inhibitable  protease that activates multiple Ced-3/ICE-like cysteine proteases. Proc Natl Acad Sci USA. 1996; 93:14486-91.
27. Darmon AJ., Nicholson DW. ,Bleackley RC. Activation of the apoptotic protease CPP32 by cytotoxic T-cell-derived  granzyme B. Nature 1995; 377: 446 - 448.
28. Martin SJ., Amarante-Mendes GP., Shi L., Chuang TH.,  Casiano CA., O'Brien GA., et al. The cytotoxic cell protease  granzyme B initiates apoptosis in a cell- free system by  proteolytic processing and activation of the ICE/CED-3family  protease, CPP32, via a novel two-step mechanism. EMBO J. 1996; 15: 2407-2416.
29.  Andrade F., Roy S., Nicholson D., Thornberry N., Rosen A., Casciola-Rosen L. Granzyme B directly and efficiently  cleaves several downstream caspase substrates: implications for CTL-induced apoptosis. Immunity 1998; 8: 451-460.
30.  Nakamura K, Bossy-Wetzel E, Burns K, Fadel MP., Lozyk M. et al. Changes in endoplasmic reticulum luminal environment affect cell sensitivity to apoptosis. J Cell Biol 2000; 150: 731-740.
31.  Rao RV., Hermel E., Castro-Obregon S., del Rio G., Ellerby LM. et al. Coupling endoplasmic reticulum stress to the cell death program: mechanism of caspase activation. J Biol  Chem 2001; 276: 869-874.
32.  Hirata H., Takahashi A., Kobayashi S., Yonehara S., Sawai H., Okazaki T. et al. Caspases are activated in a branched protease cascade and control distinct downstream processes in Fas-induced apoptosis. J Exp Med.  1998;187:587-600.
33.  Casciola-Rosen L, Nicholson DW, Chong T, Rowan KR, Thornberry NA, Miller DK, et al. Apopain/CPP32 cleaves proteins that are essential for cellular repair: a fundamental  principle of apoptotic death. J Exp Med. 1996 May  1;183(5):1957-64.
34.  Song Q., Lees-Miller SP., Kumar S., Zhang Z., Chan DW., Smith GC. DNA-dependent protein kinase catalytic subunit: a target for an ICE-like protease in apoptosis. EMBO J.  1996;15:3238-3246.
35.  Liu X, Kim CN, Yang J, Jemmerson R, Wang X. Induction  of apoptotic program in cell-free extracts: requirement for dATP and cytochrome c. Cell. 1996; 86:147-157.
36.  Chen WJ, Huang YT, Wu ML, Huang TC, Ho CT, Pan MH. Induction of apoptosis by vitamin D2, ergocalciferol, via reactive oxygen species generation, glutathione depletion, and caspase activation in human leukemia Cells. J Agric Food Chem. 2008 May 14;56(9):2996-3005. Epub 2008 Apr
37.  Zou H, Henzel WJ, Liu X, Lutscha A, Wang X. Apaf-1, a human protein hoınologous to C.elegans CED-4, participates  in cytochrome c-dependent activation of caspase-3. Celi. 1997;90:405-13.
38.  Ulukaya E. Apoptozis ders notları. Uludağ Üniversitesi Tıp Fakültesi, Biyokimya Anabilim Dalı 2003;15-26.

Yazışma Adresi: 

Dr. K. Beril YÜKSEL 
Dr. Zekai Tahir Burak Kadın Sağlığı Eğitim ve Araştırma Hastanesi
Hamamönü / ANKARA
Tel: 0 312 310 31 00
e-mail: This e-mail address is being protected from spambots. You need JavaScript enabled to view it